【2021/05/11 Phys.org】
賓夕法尼亞州立大學(Pennsylvania State University)與美國農業部(U.S. Department of Agriculture, USDA)的研究團隊共同開發了一種CRISPR/Cas技術的病原診斷方法，能針對威脅全球約17億美元柑橘產值的「柑橘黃龍病」(Huanglongbing, 以下簡稱HLB)進行早期診斷。
此研究技術近期被發表在《植物病理學》期刊，研究人員指出該方法可以檢測出HLB的細菌病原Candidatus Liberibacter asiaticus (簡稱CLas)，其診斷靈敏度能比常用的定量聚合酶連鎖反應(Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR)方法高出100~1,000倍。
HLB在亞洲已經被報導超過一世紀，並於2005年傳入美國佛羅里達，而後曾經重創佛州柑橘產業，造成柑橘減產至少70%，動搖產值33.5億美元的美國柑橘產業。HLB是透過柑橘木蝨傳播或藉由嫁接感染枝條而罹病，柑橘植株一旦罹病就無法治癒，且大多數柑橘果樹會在幾年內死亡。其病徵包括葉片出現不對稱褪綠或黃化的病斑，果實褪綠、畸形，甚至產生苦味，以致無法販售或榨汁利用，對果汁加工產業造成極大威脅。
研究人員指出要防堵HLB擴散的最好做法是快速清除病株，因此能盡早偵測到病原是重要關鍵，因為罹病植株可能呈現無症狀的狀態數個月甚至達數年。截至目前為止，犬隻嗅覺偵測與qPCR已被應用於診斷柑橘植株是否感染CLas，但因此二技術不足以早期診斷出無病徵植物組織內的少量CLas，因此不適合作為田間高通量診斷用途。為能解決早期診斷病原的需求，賓州州立大學農業科學學院植物病理學教授Yinong Yang將CRISPR/Cas這種強大的基因編輯技術應用於分子生物診斷工具。
CRISPR/Cas技術是藉由DNA切割酶Cas精確鎖定目標DNA區域進行該生物體的基因組修飾，包含刪除或置換特定DNA片段，以達到促進或抑制特定性狀表現。研究人員將DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter)此技術應用於偵測CLas，利用CLas DNA片段合成出一段互補的RNA片段，讓其與合成的Cas12a蛋白組合，成為具備尋找CLas DNA的型態。同時在反應環境中加入與CLas序列相同但帶有螢光標定的報導寡核苷酸(Reporter oligonucleotide)一同作用。若CLas DNA確實存在，則Cas12a不但會切割病原DNA；同時也會透過本身「附帶切割 (Collateral cleavage)」的特性一併截切周遭的螢光報導寡核苷酸，進而釋出激發態的螢光分子讓儀器偵測到信號。
CLas DETECTR可搭配使用微量盤檢測儀(Microplate reader)讀取螢光訊號，或是使用類似驗孕試劑概念的側向流體測試條來視覺化偵測結果，具有高靈敏度與高特異性的特性。賓州州立大學農業科學學院植物病理學與環境微生物學博士後研究員Matthew Wheatley對照測試傳統qPCR與CLas DETECTR檢測樣品結果後，發現了有趣的現象。以未感染的葡萄柚等柑橘類樣品作為對照組別，原先有受到感染但在qPCR測試為CLas陰性的兩項葡萄柚DNA樣品，在CLas DETECTR的分析中分別顯示CLas呈現弱陽性。
Yang教授指出CLas DETECTR的測試能與現今快篩試劑的側向流體免疫層析技術(Lateral flow technology)相容，結合核酸偵測的高靈敏度及易於使用的特性，將可為HLB好發區域的田間診斷提供快速且經濟實惠的應用前景。
《產業發展中心 產業分析組 林俞廷摘譯》
《圖片來源：Adobe Stock》
- 更多參考資料：
https://news.psu.edu/story/657996/2021/05/10/research/crisprcas-technology-could-enable-early-diagnosis-devastating
https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PHYTO-09-20-0443-R
參考網址
https://phys.org/news/2021-05-crispr-tech-enable-early-diagnosis.html